|
- funna i blod och vävnad hos cancerpatienter Forskare: Erik O.H. Enby. Författare: Ingemar Ljungqvist Sammanfattning: Genom att använda Nomarskis interferenskontrastmikroskopi (DIC) har det varit möjligt att påvisa närvaron av en riklig förekomst av mikroorganismer i tumörer från både bröst- och livmodercancer. Motsvarande mikroorganismer har också påvisats i blod från patienter med varierande typer av degenerativa sjukdomar, inkluderande cancer. Utseendet av mikroorganismerna i blodet uppvisar ett brett spektrum av olika morfologiska karaktärer. Detta utgör i sin tur ett indicium på att mikroorganismerna genomgår en utvecklingscykel. När mikrobiologin var ny som vetenskap, gjordes observationer av färskt växt- och djurmaterial direkt i ljusmikroskopet. Därmed kunde man också iaktta och begränsat i tid följa den växelverkan som utspelades mellan växt och djurceller och deras motsvarande mikroorganismer. Mikroskopiska undersökningar av mikroorganismer i blodprov blev också beskrivna och dessa studier inkluderade också blod från subjektivt friska människor. (Ref 1-3) Begränsningarna hos ljusmikroskopet gjorde emellertid det svårt att se celler och strukturen med en optisk täthet i närheten av den hos vatten. Som en följd av detta utvecklades fixerings och infärgningsmetoder. Dessa blev sedermera standardiserade och förfinade, vilket hjälpte olika forskare att bestämma och identifiera mikroorganismer eller att fastslå finare cellstrukturer. (Ref 4) Färg och fixeringsmetoderna har ytterligare utvecklats i samband med introduktionen av elektronmikroskopet. Nackdelen med infärgning, vilket inkluderar bindning med färgade kemikalier och dehydrering, är att de pågående livsprocesserna i själva objektet avbryts. Likadant påverkas eller förstörs sköra biologiska strukturer, liksom de proteiner och enzymer som skall observeras. En av de viktigaste målsättningarna med denna forskning har varit att studera livsprocesserna med minsta möjliga störning av själva objektet. En utvärdering har därför gjorts för att undersöka olika optiska möjligheter. De bästa kandidaterna för att uppnå målsättningen var att använda faskontrast (Zernicke, Ref 5), interferenskontrast (Nomarski, Ref 5) eller mörkfältsmikroskopi (Ref 5). I stället för att manipulera objektet som skall observeras, kan ljuset, dvs strålgången genom objektet, förändras genom dessa metoder och några av de tidigare begränsningarna hos ordinarie ljusmikroskop kan därför övervinnas. Vi kallar dessa tekniker för "optiska färgningsmetoder" i motsats till de gängse fixeringsmetoder som är i bruk. Efter att ha utrustat ett standard Leitz Dialux 20-mikroskop med kompletterande mörkfält, faskontrast och interferenskontrast, så kan studierna med ljusmikroskopi utvidgas. De relativt nya teknikerna har inneburit ett nytt analytiskt verktyg i studierna av levande mikroskopiska objekt. Detta blev speciellt tydligt i de primära undersökningar av mänskliga vävnader och vätskor som utfördes, då undersökningar av dessa har varit endast sporadiskt rapporterade. (Ref 6) Användningen av interferenskontrastmikroskopi initierades redan 1983 av Erik O.H. Enby och under de mer än tio år som gått har såväl erfarenheten som resultaten från olika observationer ackumulerats (Ref 7). Dessa undersökningar inriktades ursprungligen mot undersökning av vitalt blod från både kontrollpersoner och patienter med cancerdiagnos eller med andra kroniska sjukdomar (Ref 8). På grund av etiska restriktioner var det endast möjligt att studera ett fåtal typer av nytagna, opåverkade tumörbiopsier. I detta manuskript rapporteras observationer baserade på fynd utförda med interferenskontrast. Vår förhoppning är att dessa fynd kommer att initiera en ny vetenskaplig inriktning för en bättre förståelse av cancergåtan. Mikroskopet användes huvudsakligen med en förstoring på 1200x. Standardtyper av objekt- och täckglas användes. Blodprovet togs från fingerblomman på försökspersonen och bloddroppen fästes på objektglaset via kapillärverkan. Starka antiseptiska medel undveks omedelbart före provtagning, för att utesluta inverkan på sköra membran. Efter att ett stort täckglas som täcker hela objektglaset lagts på, vidtar omedelbart mikroskopering, där blodet kan observeras och analyseras. Den normala förekomsten av hudens mikroflora skulle också kunna utgöra del av preparatet men erfarenhetsmässigt kan dessa urskiljas som föroreningar och är därför uteslutna från den fortsatta beskrivningen. Cancervävnaden från livmodern som användes vid undersökningen erhölls från nytagna biopsier. Här skulle likaledes kontaminering från exempelvis den normala mikrofloran i slidan kunna påverka analysen. Erfarenheten gör att dessa uteslutes. Cancervävnaden pressades sedan ut, med hjälp av ett extra objektglas, tills den utgjorde ett tunt skikt. Genom att täcka täckglasets kanter med extra immersionsolja, förlängs tiden för uttorkning av preparatet. Detta möjliggör en observationstid på över hundra timmar och den dynamiska processen kan följaktligen följas under avsevärd tid. Den normala rutinen vid mikroskopering är att inleda med normalt ljusfält med en moderat förstoringsgrad, 100x, för att erhålla en överblick av preparatet. Områden i objektet som kräver mer noggranna undersökningar observeras sedan med en relativt hög förstoringsgrad, 1200x, i kombination med interferenskontrast. l blodpreparat från subjektivt friska individer kan små runda, oregelbundet vandrande partiklar enkelt observeras i plasman i utrymmet mellan erytrocyterna. Diametern hos dessa partiklar är mindre än 500 nm och plasman i övrigt ser klar ut. (Bild 1) 
Bild 1. Bloduttryck från en frisk person. Erytrocyterna i de röda blodkropparna dominerar bilden. Två vita blodkroppar kan också urskiljas. Plasman mellan blodkropparna är klar och ren. De mindre snabbt rörliga partiklar, som kan urskiljas hos friska, kan urskiljas vid direkt mikroskopering men går, som här, oftast förlorade vid fotografering.
I preparat från patienter med olika typer av kroniska sjukdomar är dessa små partiklar mindre frekventa. I stället förekommer ganska stora mikrob-liknande bildningar i plasman tillsammans med röda och vita blodkroppar. De mikrob-liknande bildningarna uppvisar ett brett spektrum av olika morfologiska karaktärer. Mest frekventa är stav och kock-formade partiklar. (Bild 2) 
Bild 2. Blod från en patient. Av de röda blodkroppama som dominerar bilden har de flesta förlorat sin jämna yttre kant. De har i stället antagit en mer eller mindre spikklubbeliknande fas. I plasman uppträder tydligt ett par tre avlånga, spermieliknande mikroorganismier, som tar sig fram i plasman med en egenrörelse.
Dessutom uppträder, fast mindre frekvent, större former av mikroorganismer, vilkas längd kan vara mångdubbelt erytrocytens. Även om erytrocyterna kan urskiljas klart vid 100x förstoring med ljusfältsteknik, är de ovan nämnda större formerna av mikroorganismer ej urskiljbara förrän interferenskontrasttekniken tas i bruk. Stora sammansatta formationer, sk hopar, kan också observeras i preparaten. Dessa hopar kan ibland bestå av upp till tiotusentals jästliknande partiklar med en partikelstorlek av 0,5 till 3 µm (Bild 3). 
Bild 3. Blod från en patient. I kanten av bilden känns erytrocyterna igen. I centrum ligger en stor grynliknande struktur, en sk hop, som omedelbart efter provtagning tycks vara vilande.
Hela hopen kan, förutsatt den är tillräckligt stor, också urskiljas med ett obeväpnat öga på preparatet som ljusa fläckar. Omedelbart efter provtagning tycks dessa partiklar vara i vila. Emellertid kan man iaktta att dessa partiklar efter ett par timmar börjar uppvisa rörelse. Denna rörelseaktivitet stegras sedan dramatiskt och partiklarna vandrar ut till omkringliggande blodkroppar där en viss form av växelverkan vidtar. Efter ytterligare tid kan på så vis hela den ursprungliga hopformationen lösas upp. (Bild 4) 
Bild 4. Blod från en patient. De röda blodkropparna är lätt identifierbara, fastän de här har lagt sig i sk myntrullar. Från hopen i bildens överkant frigör sig nu ett flertal mikroorganismer, som vandrar ut i plasman mellan de röda blodkroppama.
I vävnaden från livmodercancern kunde iakttas sfäriskt formade granuler. Dessa hade en undulerande rörelse i de delar av preparatet som var vätskefyllda, medan de uppvisade en mycket svag rörelse i de delar där de tycktes vara förankrade i fast vävnad. Deras storlek varierade mellan 0,5 till 10 µm. I undersökningen av vävnadsprover från livmodercancer var dessa granuler mycket större om de var tagna från patienter med en långt gången cancer (Bild 5-6). 
Bild 5. Tumör sedd efter preparering i interferenskontrast. Bilden domineras av sfäriska granuler som har en oscillerande rörelse. Storleken varierar.
Bild 6. Samma som ovan, men här har en av dessa jästsvampsliknande sfärer påtagligt ökat i volym.
Ytterligare en högintressant observation gjord med interferenskontrastmikroskop var bildningen av mycel eller trådliknande strukturer, vilka kunde noteras antingen direkt efter preparatet färdigställts för mikroskopering eller kunde dessa utvecklas efter inkubering av vävnaden. De mycel-liknande bildningarna förekom alltid tillsammans med de sfäriska granulerna. Granulerna var då placerade längs med filamenten och då var de också helt stilla (Bild 7). 
Bild 7. Tumör i interferenskontrast. Parallellt med granulerna återfinns också stråk med bandliknande filament, som kan genomkorsa vävnaden.
I mycket svårt sjuka patienter kunde även i blodprovet från dessa noteras att stora delar av deras blodkroppar tycktes helt förstörda ifall de var i kontakt med ovan nämnda strukturer (Bild 8). 
Bild 8. Blod från patient. De röda blodkroppama på denna bild har fått ett förändrat utseende, då de påverkas av de mindre sfäriska mikroorganismerna.
Den kvantitativa andelen av dessa mikrobliknande strukturer observerade i interferenskontrastmikroskopi skulle kunna uppskattas till att de utgjorde bortemot 50% av den totala tumörvolymen.
Under hela det snart gångna århundradet har ljusmikroskopet använts av forskare och liknande observationer har också tidigare gjorts för vissa av fynden. Vid en genomgång av litteraturen på området har vi funnit att flera forskare också varit benägna att klassificera fynden och då gett dem namn. I efterhand kan man konstatera att detta arbete att också klassificera fynden snarare har skapat förvirring än det bidragit till en ökad förståelse och ett erkännande av forskningsområdet. Vi har därför funnit det mest lämpligt att enbart ge dessa mikroorganismer vi observerat samlingsnamnet cellväggsfria mikroorganismer. Denna uppfattning delas av Lida Mattman, som i boken "Cell-Wall deficient forms - Stealth pathogens" har sammanfattat observationer gjorda såväl i mikrobiologins barndom, som fram till nutida undersökningar (Ref 10). Därtill har Macomber (Ref 11) och Cantwell (Ref 12) föreslagit liknande definitioner, detta baserat på studier mestadels avseende cancer. Medan vetenskapen i början var intresserad av de pleomorfa dragen hos mikroorganismer, så blev denna inriktning mer eller mindre negligerad i och med upprättandet av den moderna taxonomin, där en art definierades i enlighet med sina specifika egenskaper och där morfologin utgjorde en viktig del. Det har emellertid funnits indikationer under hela undersökningstiden, att dessa mikroorganismer genomgår en utvecklingscykel (Ref 1, 2, 6). De fenomen som observerats skulle således endast vara ett tecken på en metamorfos, ett i biologin vanligt fenomen t ex hos fjärilar. I konsekvens därmed skulle det vara möjligt att de olika formerna av en och samma art, men tagen i olika faser av utvecklingscykeln, har blivit beskriven som flera olika arter. En fördjupad framtida undersökning, där mikrobiella utvecklingscykler tas i beaktande, skulle möjligen kunna leda till att antalet arter reducerades. Genom att jämföra morfologin och utseendet på de mikroorganismer som funnits hos såväl friska som hos cancerpatienter, har vi tolkat observationerna som att det finns ett samband mellan dessa och sjukdomen. Det finns även en korrelation mellan mikroorganismens morfologi och graden av cancer (Ref 13). Detta samband har också noterats, förutom för cancer, för många andra kroniska sjukdomstillstånd såsom MS, lupus, astma etc (Ref 8, 10). Det är för oss uppenbart att den nutida utvecklingen av ljusmikroskopet med de beskrivna "optiska färgningsmetoderna", har öppnat nya möjligheter att studera såväl nya former av mikroorganismer, som att se deras växelverkan med såväl blod som vävnader. I konsekvens härmed borde de nya observationer som beskrivits här kunna innebära ytterligare en kraftfull informationskälla, speciellt när det gäller att skapa en större kunskap runt den hittills olösta cancergåtan. Det resultat som presenteras här, borde inte längre ignoreras, utan tas emot som ett värdefullt komplement till den molekylärbiologiska forskning med tonvikt på genetik som i dag dominerar cancervetenskapen. Sett ur denna synvinkel torde dessa undersökningar med ovannämnda teknik kunna utvecklas ytterligare för att utvidga vår gemensamma kunskapsbas. Vi vill tacka Dr Ramesh Singh Chouhan, Pondieherry, Indien, som bistått med biopsimaterial och med värdefull hjälp vid mikroskopet. Vi vill också tacka docent Lennart Sjölin, CTH/GU, Göteborg för värdefull hjälp vid utformningen av manuskriptet. Den fristående organisationen Cancerhjälpen har bistått oss med finansiell hjälp, vilket möjliggjort föreläsningar internationellt. Vi vill också tacka professorerna Annica Dahlström, Lennart Adler, Torbjörn Lagerwall, Hans Wigzell, Ray Keamey, Walther Url och Wolfgang Köstier, för att de stimulerade oss att gå vidare i vår forskning. Referenser: [1] Béchamp, Antoine. The blood and its third anatomieal element. Boericke & Tafel, Philadelphia, 1911. [2] Enderlein, Günther. Bacterien-Cyclogenie, 2nd ed. Semmelweiss-lnstitut, Hoya, Germany, 1982. [3] Almquist Ernst. Biologische Forschungen über die Bakterien. Norstedt & Söner, Stockholm 1925. [4] Clark G.L. Staining procedures used by the Biological Stam Commission, third edition. Williams & Wilkins, Baltimore 1973. [5] Atlas R. M. "Microscopical methods" in Microbiology, Macmillan Publ., New York, USA, 1989 (s. 38-67). [6] Bleker, Maria-M. Blood examination in darkfield. Semmelweiss-Verlag, Hoya, Gerrnany, 1993. [7] Enby, Erik O.H: Mikrobliknande bildningar i blod vid kroniska sjukdomar. Swed. J. Biol. Med. 1984: 1: 22-26. [8] Enby, Erik O.H. Die Präsenz zyklischer mikrobischer Prozesse. Hoya, Semmelweiss-lnstitut, 1989. [9] Enby, Erik O.H, Chouhan R.S., Rajaram P., Habeebulla S. lnterference contrast microscopy of tissue from cancer cervix patients. Int. J. Gyn. & Obst. 1994: 46 suppl 2: V 107.3. [10] Mattman, Lida H. Microbes and malignancies in Cell wall deficient forms - Stealth pathogens. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 1993 p. 311-321. [11] Macomber, PB. Cancer and cell-wall deficient bacteria. Medical hypotheses 1990; 32: 1-9. [12] Cantwell, A, Jr. The cancer microbe. Aries Rising Press, Los Angeles, USA. 1990 [13] Enby, Erik O.H., Ljungqvist, Q.I. The decay process as the cause of disease and death, and microbial formations in the blood of chronically diseased. In: Proccedings of the 1:st world congress on cancer. Sydney, Australia, 1995; p.161-171. |